Autor/s. : Danyel Bueno Dalto, David
Fernandes Gavioli, E.R. Oliveira, R.A.M. Silva e Marina
Avena Tarsitano , Alunos de
pós-graduação, Universidade Estadual de Londrina -UEL-, PR; Á.H.S.
Altmann, Aluno de graduação, UEL, PR; Débora
B. Braz, M. Cassab Comércio e
Indústria Ltda, SP, e R.K.T.
Kobayashi, E.J. Venâncio, Ana
Maria Bridi, Ana
Paula Bracarense e Prof. Dr. Caio Abércio Silva,
UEL, PR.
Sumário
Foram avaliados os efeitos do plasma sanguíneo desidratado (PSD)
sobre desempenho, perfil imunológico, histológico, microbiológico e peso de
órgãos de leitões leves, desmamados aos 21 dias de idade. Foram utilizados 24
leitões, com idade média inicial de 21 dias, em delineamento experimental
completamente ao acaso. Os tratamentos foram: T1 - animais pesados ao desmame,
sem suplementação com PSD; T2 - animais leves ao desmame, suplementados com
10g/animal/dia de PSD; T3 - animais leves ao desmame, suplementados com
20g/animal/dia de PSD; T4 - animais leves ao desmame, sem suplementação com
PSD. A adição de 20g de PSD na dieta melhorou o ganho diário de peso, aumentou
o peso (g/kg) do baço e o título de IgA
no soro entre 21 e 31 dias de idade. A inclusão de 10g de PSD aumentou o
comprimento e a largura do linfonodo ileocólico. A inclusão de PSD traz benefícios aos leitões
nos primeiros 10 dias pós-desmame, atuando principalmente nos órgãos linfoides e na mucosa intestinal.
Palavras-chave: suíno, plasma sanguíneo desidratado, intestino delgado,
imunoglobulinas, E.coli
INTRODUÇÃO
No desmame, o leitão passa por um grande distresse,
com repercussões negativas no consumo de ração, no desenvolvimento intestinal e
na adaptação à dieta inicial, aumentando a suscetibilidade a problemas
entéricos, infecções e diarreias (Pluske
et al., 1997).
As alterações intestinais que ocorrem no pós-desmame incluem
mudanças na morfologia das vilosidades, criptas e enzimas da borda em escova,
tendo sido demonstradas implicações com patógenos
entéricos (Escherichia coli e rotavírus)
(Pluske et
al., 1997). Com o intuito de minimizar essas alterações, vários produtos têm
sido incorporados à ração de leitões recém-desmamados. O plasma sanguíneo
desidratado (PSD) é um produto com alta palatabilidade,
com níveis elevados de aminoácidos e possui imunoglobulinas que podem reduzir a
ação de patógenos intestinais, e tem sido utilizado
como ingrediente na ração de leitões em fase de creche. Dentre as propriedades
relacionadas ao PSD relata-se a redução na expressão de citocinas
pró-inflamatórias (IL-1, IL-6 e TNF-a) no tecido
intestinal (Touchette et al., 2002) e a infiltração de células
inflamatórias na mucosa intestinal (Jiang et al.,
2000).
Segundo Van Dijk et al. (2001), além da alta palatabilidade,
os efeitos positivos, provavelmente, envolvem a atividade das glicoproteínas que reforçam a proteção contra E.
coli e das imunoglobulinas adquiridas por
meio do plasma. Segundo Pierce (2005), tanto a palatabilidade
quanto os demais efeitos benéficos do PSD são relacionados aos altos níveis de IgG. É provável que a IgG previna a adesão de patógenos, como a E. coli,
no epitélio intestinal. Além disso, o PSD melhora o desempenho ao incrementar a
imunocompetência do animal pelas imunoglobulinas
presentes e reduzir a exposição do sistema imune aos antígenos, levando à menor
produção de citocinas pró-inflamatórias e ao aumento
do consumo de ração (Dritz et al., 1996). A utilização de PSD de origem suína
tem apresentado melhores resultados do que o PSD de origem bovina, sugerindo um
efeito específico de imunoglobulinas.
Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho, o
perfil microbiológico, histológico e imunológico de leitões desmamados leves,
alimentados com ração contendo plasma sanguíneo desidratado.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 24 leitões da linhagem PenArLan, sendo 16 machos castrados e oito fêmeas. A
média de idade no início do experimento foi de 21 dias. Segundo o peso inicial,
os animais foram divididos em dois grupos, um com peso inicial entre 4,5 e
5,5kg - animais leves ao desmame, e outro com peso inicial entre 5,6 e 6,5kg -
animais pesados ao desmame. Os animais foram alojados em baias de alvenaria e
piso ripado com 3m2. Em cada baia foram alojados dois animais, um macho
castrado e uma fêmea, que receberam água e ração à vontade.
Os animais foram submetidos a um dos seguintes tratamentos (T)
experimentais durante 10 dias: T1 - animais pesados, não suplementados com PSD;
T2 - animais leves, suplementados com 10g/animal/dia de PSD; T3 - animais
leves, suplementados com 20 g/animal/dia de PSD; T4 - animais leves, não
suplementados com PSD. As dietas experimentais foram formuladas para a fase
pré-inicial I, de 21 a 30 dias de idade. As rações experimentais foram
analisadas segundo as metodologias propostas pela Association
of Official Analytical Chemists, AOAC (1984),
sendo os ingredientes, a composição percentual e os valores analisados
encontrados na Tab. 1.
O suplemento proteico, vitamínico e
mineral utilizado na ração pré-inicial I (PS 400) apresentava na sua formulação
soro de leite, glúten de milho, proteína texturizada
de soja, levedura de cana, milho pré-gelatinizado, açúcar e lactose. O PSD
comercial continha as seguintes especificações: plasma sanguíneo suíno em pó
(98,2%), vitamina E e DL-metionina, apresentando 77,7% de proteína bruta, 18.000mg de metionina e 5 mg de vitamina E, sendo seu fornecimento feito diretamente
no cocho, três vezes ao dia.
Tabela 1. Composição percentual, química e energética da ração
experimental usada para leitões
Para avaliação de desempenho, os animais foram pesados nos dias
zero e 10 - dia inicial e final do período experimental, quando foram
computados: peso final (PF), consumo diário de ração (CDR), ganho diário de
peso (GDP) e conversão alimentar (CA). O delineamento experimental foi o
completamente ao acaso, com quatro tratamentos e três repetições por tratamento
(três baias com dois leitões). Cada baia, composta por dois animais, foi
definida como uma unidade experimental.
Ao final do tratamento, os animais foram abatidos após concussão
cerebral seguida de exsanguinação. O projeto foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal institucional (processo
194/2009).
Amostras de fezes foram colhidas imediatamente após o abate para
a pesquisa de Escherichia coli eLactobacillus sp.
Aproximadamente 10g do conteúdo do intestino delgado foram colhidos em frasco
estéril e mantidos em refrigeração até o seu processamento, que não ultrapassou
duas horas. As amostras foram submetidas à diluição seriada em solução salina
0,85%. A diluição 10-1 (1mL da amostra com 9mL de salina) foi homogeneizada em vortex por 30s. As demais diluições, até 10-6,
foram homogeneizadas por 10 segundos. Uma alíquota de 100μL de cada
diluição foi semeada por espalhamento em superfície em ágar
MacConkey e ágar Rogosa, para contagem de Escherichia coli e Lactobacillus sp.,
respectivamente. O ágar MacConkey
foi incubado em aerobiose, a 37ºC, por 18 a 24h. O ágar Rogosa foi incubado a 37ºC
por 18 a 24h, a 5% CO2 (Pierce, 2007). As colônias
crescidas em MacConkey com suspeita de E.
coli - colônias rosas com morfologia
típica - foram semeadas em Triple Sugar Iron Agar (TSI), SIM
Mediun -
meio de cultura que detecta a produção de H2S, indol
e motilidade, fenil, citrato e vermelho de metila (VM) para confirmação - e,
então, contadas. As colônias grandes claras, de bacilos Gram
positivos, crescidas em ágar Rogosa,
foram contadas segundo Franklin (2002).
Amostras de sangue e fezes foram colhidas para se avaliar a
concentração de IgG, IgM, IgA no soro e IgA e IgM nas fezes. O sangue foi
colhido por venipunção da veia jugular em tubo não heparinizado no início (dia zero) e no final do experimento
(dia 10).
As amostras de fezes foram colhidas após o abate e diluídas
inicialmente 1:8 em PBS 1X, homogeneizadas em vórtex
e centrifugadas a 1500g por dois minutos para obtenção do sobrenadante.
Posteriormente, as amostras de fezes e soros foram diluídas 1:20
e 1:100 em PBS 1X-glicerina 20% e armazenadas a -20ºC até o momento do
processamento. As concentrações de IgG,
IgA e IgM foram
determinadas pelo sistema ELISA Quantification Set (Bethyl-USA), seguindo as recomendações do fabricante. Para
a determinação das concentrações de IgG,
IgA e IgM no soro, as
amostras foram diluídas a 1:200.000, 1:1000 e 1:10.000, respectivamente,
enquanto os sobrenadantes das fezes foram diluídos a 1:50 e 1:200, para a
quantificação de IgA e IgM.
Os valores de absorbância, obtidos a 450nm, foram analisados pelo programa
Curve Expert 1.3.
Após o abate, o conteúdo intestinal foi removido, e o intestino
delgado, o ceco e o baço pesados. O comprimento e a largura dos linfonodos ileocólicos também
foram mensurados.
Fragmentos de duodeno, jejuno e íleo foram colhidos e fixados em
solução de formalina tamponada a 10% por 24 horas,
sendo posteriormente transferidos para solução de álcool 70%. As amostras foram
submetidas ao processamento histológico de rotina, e cortes de 5μm de
espessura foram corados pelo método de hematoxilina/eosina.
Foi realizada a contagem do número médio de linfócitos na lâmina própria em
todos os segmentos do intestino. Para tanto, utilizou-se objetiva de imersão
(100x), sendo contados 20 campos em cada lâmina.
A avaliação morfométrica foi realizada
em 30 vilosidades e criptas por lâmina, utilizando-se objetiva de 10x em
microscópio óptico Zeizz Axioskop.
A altura, a espessura das vilosidades e a profundidade das criptas foram
mensuradas com o auxílio do programa Motic Image Plus 2.0. A taxa vilosidade:cripta foi calculada dividindo-se a altura da
vilosidade pela profundidade da cripta.
O delineamento experimental para as avaliações microbiológica,
imunológica e histológica foi o completamente ao acaso, com quatro tratamentos
e seis repetições por tratamento. Cada animal foi definido como uma unidade
experimental. Os dados relativos aos tratamentos foram submetidos à análise de
variância e à comparação de médias pelo teste Tukey
utilizando-se o programa SAEG (Sistema..., 1997).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados para as características de desempenho zootécnico
estão demonstrados na Tab. 2. A diferença significativa verificada para o peso
inicial provém do desenho experimental que determinava uma estratificação dos
pesos dos leitões. Para o parâmetro peso final, foi observado melhor desempenho
para os animais pesados e para os leves tratados com 10g e 20g/dia de PSD na
ração. Considerando-se que os animais leves iniciaram o experimento, em média, um quilo mais leves em relação aos animais pesados
(tratamento 1), concluiu-se que houve uma recuperação desses leitões pela
suplementação de PSD. Entretanto, a inclusão de 10g e de 20g de PSD por dia não
determinou resultados estatisticamente diferentes entre si.
Tabela 2. Médias e desvios das características de desempenho de
leitões pesados e leves, no período de 21 a 31 dias de idade
Os mecanismos pelos quais o PSD promove estas melhorias no
desempenho dos animais ainda não estão bem elucidados, contudo acredita-se que
estejam relacionados à alta palatabilidade do
alimento (Ermer et
al., 1994), favorecendo o consumo. Os resultados obtidos, entretanto, diferem
dos encontrados por Ermer et al. (1994), visto que não houve diferença
(P>0,05) para o CDR, demonstrando não ter havido favorecimento para melhora
do consumo para os tratamentos com 10g e 20g de PSD em relação aos demais
grupos. Os resultados também diferem dos encontrados por Gatnau
e Zimmerman (1991), que, oferecendo individualmente
dietas com PSD e com leite em pó durante as duas primeiras semanas pós-desmame,
observaram que os leitões consumiram 50% mais ração com PSD em relação às
dietas com leite em pó. Butolo et al. (1999) observaram efeito linear significativo
para o consumo de ração no período de zero a 14 dias pós-desmame para leitões
alimentados com inclusões crescentes de PSD (0, 2,5, 5,0 e 7,5%).
Para o GDP houve diferença (P<0,05) a favor do tratamento com
suplementação de 20g de PSD em relação ao grupo de leitões leves que não
receberam o plasma. Gatnau e Zimmerman
(1991), ao compararem a inclusão de 5% de PSD versus uma dieta com 7,5% de
farinha de sangue durante duas semanas pós-desmame, observaram que houve melhor
GDP, CDR e CA para o tratamento com plasma. Kats
(1994) demonstrou aumento linear do GDP, CDR e melhor CA nos primeiros 14 dias
pós-desmame com a inclusão de 2,0, 4,0, 6,0 e 8,0% de PSD nas dietas. No
presente trabalho, as inclusões de PSD representaram 3,5 e 7,0% do consumo na
fase pré-inicial I para o tratamento com 10g e 20g de oferta de plasma,
respectivamente.
Com o intuito de verificar o efeito do PSD sobre algumas
características de órgãos relacionados aos sistemas imune
e digestório, foram realizadas mensurações dos pesos
dos órgãos, absoluto e percentual, em relação ao peso vivo inicial e medidas
dos linfonodos ileocólicos.
Os resultados dessas avaliações estão demonstrados na Tab. 3.
Tabela 3. Peso absoluto (g) e peso percentual (g/kg de peso vivo) do
intestino delgado, ceco e baço e comprimento e largura do linfonodo
íleocólico (cm) de leitões pesados e leves aos 31
dias de idade
Os leitões pesados apresentaram peso do intestino delgado
significativamente maior do que o grupo de leitões leves e sem PSD. Não houve
diferença significativa em relação aos outros grupos e em relação ao peso vivo
(g/kg de peso vivo). Este resultado entre o peso absoluto para os leitões
pesados e os demais pode ser naturalmente atribuído ao maior peso inicial dos
animais no começo do teste. Resultados semelhantes foram descritos por Pluske et
al. (2003), os quais observaram que o peso do estômago, do intestino delgado,
do ceco e do cólon eram maiores em leitões pesados e mais velhos ao desmame. Os
autores verificaram que, em valores percentuais (g/kg peso vivo), os leitões
leves e mais novos ao desmame possuíam intestino delgado maior, no entanto, com
o aumento da idade, essa diferença tornou-se insignificante.
Verificou-se aumento significativo no peso percentual (g/kg de
peso vivo) do baço (Tab. 3) no grupo tratado com 20g/dia de PSD (tratamento 3).
Este resultado pode ser devido ao maior consumo de proteínas determinado pela adição
de PSD na dieta, um ingrediente com 77,7% de proteína bruta, resultando no
consumo total no período, de 217,6g de proteína a mais em relação aos
tratamentos 1 e 4.
Os leitões pesados e leves suplementados com PSD apresentaram
valores superiores para as medidas de comprimento e largura dos linfonodos ileocólicos em relação
aos animais que não receberam PSD (Tab. 3). Estes resultados sugerem que o PSD
contribui para melhorar a imunocompetência dos
animais. Em outros estudos utilizando PSD na alimentação de leitões, não foram
constatadas diferenças significativas no peso do baço e do intestino (Owusu-Aisedu et
al., 2003).
Os efeitos do PSD na morfologia intestinal foram avaliados por
meio da morfometria das vilosidades intestinais, da
contagem do número de linfócitos na lâmina própria e de placas de Peyer. Não houve diferença significativa entre os grupos em
relação ao número de linfócitos e de placas de Peyer
(dados não demonstrados). Ao compararem leitões de 14 dias submetidos a dietas
com e sem PSD, Jiang et al.
(2000) observaram redução na densidade de leucócitos na lâmina própria do
intestino nos animais que receberam PSD, sugerindo um efeito supressor na
resposta pró-inflamatória local.
Os resultados das medidas de altura e espessura das vilosidades,
profundidade das criptas e taxa vilosidade:cripta
estão demonstrados na Tab. 4. Em todos os segmentos avaliados observou-se que os animais não suplementados com PSD
apresentaram, na maioria dos parâmetros avaliados, valores inferiores aos
demais tratamentos, indicando que os leitões suplementados com PSD obtiveram um
desenvolvimento intestinal superior aos não suplementados, igualando-se aos
animais pesados. Melhora na morfologia intestinal independentemente do consumo
de ração e incremento na altura de vilosidades e GPD associados à ingestão de
PSD foram descritos em leitões (Torrallardona et al., 2003). No entanto, em
outro estudo, não se verificou diferença na morfologia duodenal em leitões aos
sete e 14 dias após o desmame tratados com PSD, e aos 28 dias pós-desmame a
espessura da parede do duodeno e a profundidade das criptas foram
menores nos animais alimentados com PSD (Carlson
et al., 2005). Outros autores sugerem que o PSD age
atenuando a atrofia das vilosidades do intestino delgado (Jiang et al., 2000) ou mantendo a
integridade da mucosa intestinal em animais desafiados oralmente com E.
coli K88+ (Bosi et
al., 2004).
Tabela 4. Medidas de altura e espessura das vilosidades,
profundidade das criptas e taxa vilosidade:cripta do
duodeno, jejuno e íleo de leitões pesados e leves aos 31 dias de idade
No íleo, observou-se diferença (P<0,05) na altura das
vilosidades com vantagem para o tratamento 2 em relação ao 4
e na profundidade das criptas com maiores valores para o tratamento 2 em
relação ao 3. Esta hiperplasia das criptas associada ao aumento das vilosidades
é característica do período de recuperação intestinal, que se inicia de quatro
a cinco dias após o desmame (Carlson et al., 2005), demonstrando que a
adição de PSD na dieta de leitões recém-desmamados promoveu uma recuperação
intestinal mais rápida.
Os resultados não apresentaram diferença significativa para a
contagem de bactérias Gram negativas,Escherichia coli e Lactobacillus sp. entre os tratamentos, no entanto foram observados
coeficientes de variação muito elevados para ambas as contagens.
O efeito do tratamento com PSD sobre os títulos de IgA, IgM
e IgG séricas nos leitões foi avaliado (Tab. 5). Observou-se
aumento significativo do título de IgA
entre os 21 e 31 dias de idade nos animais que receberam suplementação com 20g
de PSD (tratamento 3), indicando um possível efeito do PSD sobre os títulos de IgA sérica.
Tabela 5. Títulos de IgG,
IgA e IgM séricas de
leitões pesados e leves aos 21 e 31 dias de idade
Não foi observada diferença (P>0,05) para os títulos de IgG, IgA
e IgM séricas entre os tratamentos. Este resultado
sugere que a concentração de imunoglobulinas dos leitões pesados, bem como dos
leves, foi igual ao desmame, igualdade que se manteve independentemente da
suplementação com PSD. Os títulos iniciais semelhantes sugerem que o peso médio
inicial não interferiu na imunidade dos leitões. Possivelmente, os animais
leves ao nascimento tiveram acesso a quantidades suficientes de colostro e,
portanto, desenvolveram boa imunidade passiva, mas por fatores diversos (como
hierarquia de tetos, frio, manejo inadequado) tiveram seu desempenho
prejudicado. Já os títulos finais semelhantes poderiam ser explicados pela
baixa exposição desses animais a patógenos, visto que
não houve desafio durante o experimento. Ressalta-se que os efeitos positivos
do PSD são mais perceptíveis quando os animais são submetidos a desafios e às
condições adversas de manejo, ou seja, a maior resposta provém quanto maior é a
exposição aos patógenos (Stahly,
1996). Gatnau e Zimmerman
(1991) demonstraram que a magnitude de resposta ao PSD foi maior em leitões
alojados em sistema contínuo em relação ao sistema all-in all-out.
Os títulos de IgA
e IgM fecais também foram avaliados, e os resultados
estão dispostos na Tab. 6. Houve diferença (P<0,05) para os títulos de IgA nas fezes. Segundo Pabst et
al. (1988), os órgãos linfoides, em especial as
placas de Peyer, têm um papel fundamental no início
da resposta imune de mucosa, em particular na produção de IgA,
dada a maior presença de células B (precursoras de IgA)
em relação às células T. Segundo Gaskins (1995), a
imunidade ativa do intestino não ocorre antes de quatro-sete
semanas de idade, o que sugere que os leitões leves ao desmame, ao receberem
uma dieta de qualidade e em ambiente adequado, podem apresentar uma produção de
anticorpos de mucosa satisfatória, superando os leitões pesados, como pode ser
observado na comparação entre os leitões pesados e os leitões leves que
receberam 10 g/animal/dia de PSD.
Tabela 6. Títulos de IgA
e IgM fecais de leitões pesados e leves aos 31 dias
de idade
CONCLUSÕES
O fornecimento de PSD, nas inclusões de 10 ou 20g/animal/dia,
nos primeiros 10 dias pós-desmame, proporciona benefícios ao desenvolvimento
dos leitões, com ênfase na maturação de órgãos linfoides
e na proteção da mucosa intestinal, garantindo maior ganho de peso aos leitões
leves ao desmame.
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